小鼠骨骼肌细胞分离培养实验指南

小鼠骨骼肌细胞(Mouse skeletal muscle cell)，成熟功能单元为肌纤维(myofiber)，属于多核横纹肌细胞;体外实验常研究其前体：卫星细胞(MuSC)→成肌细胞(myoblast)，成肌细胞融合形成多核肌管，再成熟为肌纤维。

产品介绍 小鼠骨骼肌细胞分离试剂盒，采用组织解离消化法，通过破碎小鼠四肢骨骼肌(股四头肌、腓肠肌)，降解胶原、基底膜，释放肌间隙单核细胞(卫星细胞、成纤维细胞、免疫细胞、FAP)，得到单细胞悬液，后续再进行分选、培养，得到小鼠骨骼肌细胞。

小鼠骨骼肌细胞分离实验步骤

实验前准备：小鼠骨骼肌细胞组织专用消化酶、小鼠骨骼肌细胞组织处理缓冲液(冰)、小鼠骨骼肌细胞专用培养基;实验需自备手术器械、6孔/10 cm培养皿、70 μm滤网、离心管若干。以下以5只C57BL/6J为例：

1. 选用5只6 d左右的新生鼠，处死后放置75%酒精中浸泡3-5 min，随后小心剪取后肢肌肉剔除脂肪、筋膜，以免引入杂细胞，用适量小鼠骨骼肌细胞组织处理缓冲液漂洗2-3遍，随后将组织块置于1.5 mL Ep管或6 cm皿中。(建议在冰上操作，减少组织缺氧和细胞损伤)

2. 将肌肉块剪成浆状后(尽可能的剪碎，否则可能会消化不充分)，加入3倍体小鼠骨骼肌细胞组织专用消化酶，于37℃、5%CO2培养箱中消化15 min(期间可取出3次用巴氏管进行轻柔吹打10下左右)。

3. 用5倍体积小鼠骨骼肌细胞专用培养基中止消化，再用70 μm滤网过滤细胞悬液至新的50 mL离心管中，1400 rpm离心10 min，弃上清。

4. 离心后的细胞沉淀用2-3 mL小鼠骨骼肌细胞专用培养基重悬后，铺至6孔板内(标记为孔1)，于37℃、5%CO2培养箱中培养30分钟记为第一次贴壁。

5. 30分钟后吸取上清转移至6孔板的另外一孔(孔2)，过夜培养(孔1的细胞为非目的细胞，无须保留)。

6. 24小时后吸取孔2的上清液进行离心：1000 rpm，5 min，同时孔2需要添加新的小鼠骨骼肌细胞专用培养基进行培养(孔2的细胞为目的细胞)。

7. 孔2上清液离心完毕后去除上清，加入新的小鼠骨骼肌细胞专用培养基重悬后铺至6孔板内新的孔(孔3，亦为目的细胞)。

8. 24小时后对孔2和孔3贴壁的细胞进行换液，之后可每48小时换液一次。

注意事项

1. 建议全程分离操作过程在冰上进行，可提高细胞活性。

2. 小鼠骨骼肌细胞专用消化酶、培养基中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。