人脐静脉内皮细胞（HUVEC）原代分离、鉴定及培养

背景介绍

人脐静脉内皮细胞分离自脐带组织；它是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构，脐带中通过尿膜的血管即脐动脉和脐静脉，卵黄囊的血管即脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。在子宫中，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管，与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行CO2和O2，代谢产物即代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿。

试剂：PBS，胰酶，ECM完全培养基，HUVEC专用消化酶，脐带运输保存液

器械：注射器，手术钳，T25培养瓶，玻璃大皿，灌胃针

提前将使用手术钳，灌胃针及玻璃大皿高温灭菌，准备所需要的分离试剂。

1.将 15-20 cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液（添加双抗和肝素钠）中储存。（注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃）

2. 使用50 mL注射器，每次可以灌满新鲜PBS后可以用止血钳夹住脐带两端，轻缓揉捏，将脐带内的血块化开，方便冲洗干净。

3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入15 mL （灌满为标准）的HUVEC专用消化酶，室温下消化15-20分钟，有条件的话放置到37摄氏度的环境中，消化期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。

4. 消化完后，先用钝头针头疏通下端流出口，防止阻塞，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 mL 无菌离心管中，管内要有部分全培养基，或者纯血清，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带2-3次，每次都要用手轻微揉动。

5. 将收集液，置于离心机1000 rpm 离心3分钟。

6. 倒去上清，加入10 mL ECM培养基，用巴氏管吹散细胞，将所有液体转入T25培养瓶中，37℃培养。

7. 培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的 PBS 溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10 mL新鲜的ECM培养基。

8. 以后每2天换一次培养基（每次换掉 2/3 的培养基）。

9. 一般培养5-7天，细胞可长满至 80-90%单层，这时可以传代。

1. 倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2- 3 mL 消化液（0.25% 胰酶+0.1% EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

2. 用巴氏管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个 50 mL无菌离心管中，置于离心机1000 rpm离心 3 分钟。

3. 倒掉上清，加入10 mL新鲜培基，一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶，以后照此传代培养。

4. 一般传代 2-3 代（培养了 20 天左右）用于做各种实验效果最好。P6代以内实验结果收到认可。

细胞贴壁生长，呈短梭形或铺路石样向前排列，上皮细胞样。

一般的标准为VWF,CD31,VIMTENMIN为阳性（>95%）

成管实验