小鼠脂肪间充质干细胞原代分离、培养及鉴定 (白色脂肪)

1. 3天龄到4周龄（推荐周龄小）小鼠1只，麻醉处死，75%乙醇浸泡消毒3-5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤，暴露腹股沟脂肪垫。

2. 钝性剥离脂肪组织，清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎，转移至15 mL离心管中。

3.加入3-4倍体积的脂肪干细胞组织分离液，37℃水浴振荡约20 min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织，辅助消化。

4.250×g，4℃，离心5min。注意离心机预冷至4℃。

5.小心吸去上层油脂，注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基，重悬沉淀，过40μM细胞筛到新的离心管中，再次离心5min。

6.重复洗涤一次，吸去上清。

7.加入8 mL完全培养基重悬沉淀，转移至培养皿中，置于37℃，5% 二氧化碳培养箱中。

8.待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。

9.换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。

10.以后每两天更换一次培养基，细胞汇合达80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次传代。

原代培养后，传代2-3次，ADSCs呈现单层，梭状或多枝状的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞，贴壁较牢固。

一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性（>70%）；CD34、CD45、CD11b为阴性（<5%）。

在特定的诱导条件下，脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。